Involvement of the NLRP3 inflammasome in the detection of bacterial toxins and during COVID-19

Description

The innate immune detection of pathogenic microbes is crucial to enhance the immune response. During an infection, the activation of the innate immune system is the first step to establish an adaptative immune response. A physiological immune response is defined as adapted to the microbial environment and as an effectively resolved inflammation. To do so, the host must be able to qualitatively and quantitatively detect microbes. The detection of conserved MAMPs allows the host to evaluate the number of microbes. On the other hand, the detection of virulence factors' activity – pathogen-specific – give a qualitative view of microbes.The discovery of inflammasomes has allowed a major advance in the understanding of the mechanisms of detection of pathogen- and danger associated molecular patterns. Inflammasomes are macromolecular complexes responsible for the activation of Caspase-1 and the maturation of IL-1ß and IL-18. Initially discovered for their involvement in autoinflammatory pathologies, there is growing evidence for the role of inflammasomes in detecting the activity of toxins and microbial effectors including those targeting Rho GTPases.Rho GTPases are located at the crossroads of major cell signaling pathways; by regulating cell migration, phagocytosis or even gene transcription, these are major players in immunity. This makes them preferential targets for pathogenic microorganisms. Indeed, more than 30 bacterial virulence factors manipulate Rho GTPases using various strategies leading to their inhibition or activation.The uropathogenic Escherichia coli (E. coli) is the primary cause of cystitis and pyelonephritis and in the most severe cases of bacteremia. More than a third of uropathogenic E. coli possess the CNF1 toxin, a de-amidase that activates Rho GTPases. This modification destroys the intrinsic GTPase activity stimulated by the GAPs (GTPase-activating protein) of Rho, Rac and Cdc42.Before my arrival at the laboratory, Dr. Laurent Boyer's team showed that the CNF1 toxin induces an immune response. Indeed, during bacteremia in mice or systemic infection in drosophila, E. coli expressing CNF1 are eliminated more quickly than E. coli deleted for CNF1. At the cellular level, the activation of Rho GTPases by CNF1 is responsible for the production of pro-inflammatory cytokines. Alongside this transcriptional response, the CNF1 toxin causes IL-1β to mature in a Caspase-1 dependent fashion, suggesting the involvement of an inflammasome.My thesis project was to identify the inflammasome involved in the detection of the CNF1 toxin and to characterize the signaling pathway leading to this activation.We have identified the NLRP3 inflammasome as being responsible for the detection of GTPase Rac2 activation by the CNF1 toxin. We then studied the role of the kinase Pak1, a major effector of Rac2, in this signaling pathway and we were able to show that Pak1 plays a crucial role in the activation of the inflammasome NLRP3 by CNF1. Pak1 phosphorylates Thr659 of the NLRP3 receptor and this phosphorylation is critical for the recruitment of the regulatory protein Nek7 and the activation of the NLRP3 inflammasome downstream of the detection of CNF1. Finally, we were able to show the major role of the Pak1-NLRP3 pathway in the establishment of an anti-virulence immune response during mice bacteremia.In addition, we used our expertise to study the activation of the NLRP3 inflammasome in patients infected with SARS-CoV-2. This study allowed us to establish the signature of the NLRP3 response in the circulating myeloid cells of COVID-19 patients and to use these parameters to define a score to predict the patients' outcome.My work on the involvement of the NLRP3 inflammasome in the detection of virulence has provided a better understanding of the mechanisms involved in an anti-infective response.

Abstract (French)

Lors d'une infection, la détection des microorganismes pathogènes est indispensable à la réponse immunitaire innée et à l'initiation de l'immunité adaptative. Une réponse immunitaire physiologique est définie comme une réponse proportionnelle et adaptée à la stimulation microbienne et doit conduire à une résolution de l'inflammation. Pour cela, l'hôte doit être capable de détecter quantitativement et qualitativement les micro-organismes. Du point de vue quantitatif, l'hôte détecte des motifs structuraux conservés au sein d'une classe de micro-organismes. D'autre part, la détection de l'activité des facteurs de virulence – spécifiques aux pathogènes – permet une détection qualitative.La découverte des PRR et plus précisément des inflammasomes a permis une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes de détection des pathogènes et des signaux de danger liés aux dommages cellulaires produits lors de l'infections. Les inflammasomes sont des complexes responsables de l'activation de la Caspase-1 et de la maturation de l'IL-1ß et IL-18. Initialement découverts pour leur implication dans des maladies auto-inflammatoires, les inflammasomes sont également impliqués dans la détection de l'activité des facteurs de virulence notamment ceux ciblant les Rho-GTPases.Les Rho-GTPases sont situées au carrefour de grandes voies de signalisation cellulaire ; en régulant la migration cellulaire, la phagocytose ou encore la transcription des gènes, ceux sont des acteurs majeurs de l'immunité. Cela en fait des cibles préférentielles pour les bactéries pathogènes. En effet, plus de 30 facteurs de virulence bactériens manipulent les Rho GTPases en utilisant diverses stratégies menant à leur inhibition ou leur activation.La bactérie E. coli uropathogène est la première cause de cystites, pyélonéphrites et dans les cas les plus graves de bactériémies. Plus de 30% des E. coli uropathogènes possèdent la toxine CNF1, une dé-amidase activant les Rho-GTPases.Avant mon arrivée au laboratoire, l'équipe du Dr Laurent Boyer a montré que la toxine CNF1 induit une réponse immunitaire. En effet, au cours de la bactériémie chez la souris ou de l'infection systémique chez la drosophile, la détection de la toxine CNF1 induit la clairance bactérienne. Au niveau cellulaire, l'activation des Rho-GTPases par CNF1 est responsable de la production de cytokines pro-inflammatoires. En parallèle de cette réponse transcriptionnelle, la toxine CNF1 provoque la maturation de l'IL-1ß de façon dépendante de la Caspase-1, suggérant l'implication d'un inflammasome.Mon projet de thèse était d'identifier l'inflammasome impliqué dans la détection de la toxine CNF1 et de caractériser la voie de signalisation menant à cette activation.Nous avons identifié l'inflammasome NLRP3 comme étant responsable de la détection de l'activation de la GTPase Rac2 par la toxine CNF1. Nous avons ensuite étudié le rôle de la kinase Pak1, effecteur de Rac2, dans cette voie de signalisation et nous avons pu montrer que Pak1 joue un rôle crucial dans l'activation de l'inflammasome NLRP3 par CNF1. Pak1 phosphoryle la Thr659 du récepteur NLRP3 et cette phosphorylation est déterminante pour le recrutement de la protéine régulatrice Nek7 et l'activation de l'inflammasome NLRP3. Finalement, nous avons pu montrer le rôle majeur de la voie Pak1-NLRP3 dans la mise en place d'une réponse immunitaire anti-virulence au cours de la bactériémie.De plus, nous avons utilisé notre expertise pour étudier l'activation de l'inflammasome NLRP3 chez les patients infectés par le SARS-CoV-2. Cette étude nous a permis d'établir la signature de la réponse NLRP3 dans les cellules myéloïdes circulantes des patients COVID-19 et d'utiliser ces paramètres pour définir un score permettant de prédire l'évolution des patients.Mon travail sur l'implication de l'inflammasome NLRP3 dans la détection de la virulence a permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués lors d'une réponse immunitaire anti-infectieuse.

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