Amyloïd beta peptide's production and degradation in Alzheimer's disease

Description

Amyloïd beta peptide, one of the main components of Alzheimer's disease, is derived from the proteolytic processing of its precursor beta-APP (Beta Amyloïd Precursor Protein). This amyloïdogenic pathway involves two proteolytic activities: beta- and gamma-secretase. The gamma-secretase activity is carried by a macro-molecular complex composed of at least four proteins, Aph-1, Pen-2, Nicastrin and presenilin 1 or 2 (PS1 or PS2), in which PS are thought to bear the catalytic site. Those PS are subjected to endoproteolysis by a "presenilinase" activity generating a heterodimer, the active form of the presenilins in the gamma-secretase complex. Gamma-secretase is known to process many substrates but its true nature is still highly discussed.
In the first part of my work, the setup of three new fluorimetric assays brought answers to a few questions: are different PS-dependent or PS-independent activities involved in the gamma-secretase activity? Are both gamma- and epsilon-secretases activities beard by only one enzyme? Does the same enzyme account for both Notch and APP epsilon cleavages?
In a second part, I established the implication of aminopeptidase A (APA) in the amyloïd beta peptide N-terminal truncation. The use of specific APA inhibitors coupled to the design of an original gamma-secretase in vitro assay was the key finding in this study.
Finally, the use of APA inhibitors available as in vivo active prodrugs will be the next step to further confirm those results and examine the effects of those drugs on the disease time-course in Alzheimer's disease mice models.

Abstract (French)

Au cours de la voie de maturation amyloïdogène, la βAPP subit l'action séquentielle de deux activités enzymatiques appelées sécrétases : la β-sécrétase puis la γ-sécrétase qui conditionne la longueur des peptides Aβ en C-terminal. L'activité γ-sécrétase dépendante des présénilines est portée par un complexe multi protéique composé d'au moins quatre partenaires : Aph-1, Pen-2, la nicastrine et les présénilines (PS1 ou PS2). Ces présénilines subissent une coupure protéolytique par une « présénilinase » qui génère deux fragments qui s'apparient en hétérodimère, forme biologiquement active au sein du complexe. La γ-sécrétase au sens générique du terme est impliquée dans la protéolyse de nombreux substrats et sa nature reste très discutée.
Dans une première partie de ma thèse, je me suis intéressé à la production du peptide amyloïde. Dans ce but, j'ai mis au point 3 dosages enzymatiques qui permettent de mesurer des activités de type γ- et ε-sécrétase hydrolysant la βAPP et ε-sécrétase clivant Notch. Ces dosages sont un outil permettant de répondre à plusieurs questions : l'activité g sécrétase est-elle portée par plusieurs enzymes, dépendantes ou indépendantes des présénilines ? Les activités g- et ε-sécrétase sont elles portées par une seule et même enzyme ? L'activité ε-sécrétase qui clive Notch est-elle identique à celle coupant la βAPP ?
Les premiers résultats obtenus avec le substrat dérivé du site γ-sécrétase sur la βAPP (JMV2660) ont permis la mise en évidence d'une activité γ-sécrétase dans un système cellulaire dépourvu de présénilines, activité qui, paradoxalement, conserve une sensibilité à un inhibiteur classique de γ-sécrétase qui interagit physiquement avec les présénilines. La mise au point des deux autres dosages a conduit à la mise en évidence de l'implication de plusieurs activités enzymatiques regroupées sous le terme générique γ-sécrétase. Au final, ces dosages, fiables et reproductibles, permettront de tester en routine et à haut débit des inhibiteurs capables de discriminer les différentes activités de type γ-sécrétase et ε-sécrétase.
Un autre aspect de mon travail de thèse a concerné la dégradation du peptide amyloïde et plus particulièrement les modifications qui se produisent au niveau de son extrémité N-terminale. Dans le cadre de cette étude, j'ai pu démontrer l'implication de l'aminopeptidase A dans la dégradation de l'extrémité N-terminale du peptide amyloïde grâce à une approche utilisant des inhibiteurs spécifiques et à la mise au point un essai enzymatique de l'activité gamma-sécrétase basé sur l'hydrolyse d'un substrat recombinant in vitro.
Nous disposons au laboratoire d'un inhibiteur d'aminopeptidase A sous forme de pro-drogue active in vivo, ainsi, nous pourrons confirmer ces résultats sur des modèles de souris transgéniques « alzheimerisées » mais également déterminer l'impact d'un traitement ciblant l'aminopeptidase A sur le développement de la pathologie.

Additional details