Functional characterization of new genes and molecular pathways implicated in developmental brain disorders

Description

Developmental Brain Disorders (DBDs) encompass a highly heterogeneous group of disorders that manifest through cognitive, motor, neurobehavioral, neuroanatomical and neurophysiological aberrations originating from developmental brain dysfunction. DBDs include, among others, Intellectual Disability (ID), some forms of epilepsy, Autism Spectrum Disorder (ASD), Attention Deficit Hyperactivity Disorder, learning and language disorders and Schizophrenia (SCZ). During my thesis, I was involved in two distinct research projects. The first project aimed at the functional characterization of new genes implicated in Early Onset Schizophrenia (EOS), ASD and ID. During this study, Whole Exome Sequencing of 9 TRIOs (affected child and both parents) was performed in order to find new genes that are involved in the pathogenesis of EOS. Probands were diagnosed with EOS, which in some cases was combined with other phenotypes such as ASD or ID. I found some very rare variants that have a putative pathological impact on the phenotype of the patients according to in silico analysis. One variant was identified in the gene Serine/threonine-protein kinase 33 (STK33) that is a distant member of the CAMK group of serine/threonine kinases. The members of this family participate in the regulation of calcium homeostasis that was shown to be altered in patients with schizophrenia. To further evaluate the pathological impact of mutation in STK33 I created a cellular model in the SH-SY5Y cell line by the CRISPR-Cas9 technique mimicking the potential variant found in the patient. To describe the phenotype of the mutated cell line, I performed the analysis of gene and protein expression as well as calcium imaging experiments. The second project during my thesis was associated with characterization of a novel spontaneous mutation in the Kcc2 gene in mouse suffering from spontaneous tonic-clonic seizures starting at the age of four months. The Kcc2 gene codes the neuronal potassium chloride co-transporter KCC2, which participates in extrusion of chloride ions from cells, protection of neuronal networks against excitotoxicity, dendrite morphogenesis and in the maintenance of the excitation/inhibition balance. Variants in this gene are believed to have a strong potential to cause neurodevelopmental dysfunctions. Most of them are associated with Epilepsy of Infancy with Migrating Focal Seizures (EIMFS), which belongs to a group of rare epileptic syndromes. We developed the present study with the aim of characterizing the first spontaneous epilepsy model in mouse due to a mutation in the Kcc2 gene by correlating neuronal activity, seizure appearance and social and cognitive behavior with gene expression. To date these functional studies were not performed since Kcc2-KO mice die few days after birth and heterozygous animals were never studied in detail. The mutation identified in our mice affects the same amino acid that has been found mutated in an EIMFS patient (R857L), offering a unique opportunity to study the etiology of EIMFS in vivo. So far, we observed that in mutant Kcc2 mice, production of the protein is strongly decreased in brain cortex, hippocampus and striatum. Moreover, cross-linking assay and immunohistochemical analysis revealed a decrease of the KCC2 protein at the membrane level. By performing intracranial ElectroEncephaloGraphy, it was possible to observe the shape of the typical spike for epileptic mouse. For the time being, behavioral studies revealed that mutant Kcc2 mice exhibit learning and memory deficits. These findings gave us a strong background for further evaluation of our model and a possibility to get further insight into the pathogenesis of EIMFS with the final purpose to define therapeutic interventions.

Abstract (French)

Les troubles du développement du cerveau (DBD) englobent un groupe très hétérogène de troubles provenant du dysfonctionnement cérébral du développement. Les DBD comprennent, entre autres, la déficience intellectuelle, certaines formes d'épilepsie, le trouble du spectre autistique (TSA), le trouble d'hyperactivité avec déficit de l'attention, les troubles de l'apprentissage et du langage et la schizophrénie. Au cours de ma thèse, j'ai participé à deux projets de recherche distincts. Le premier projet visait la caractérisation fonctionnelle de nouveaux gènes impliqués dans la schizophrénie à début précoce (SDP), le trouble du spectre autistique et la déficience intellectuelle. Au cours de cette étude, le séquençage de l'exome entier (WES) de 9 TRIOs a été effectué afin de trouver de nouveaux gènes impliqués dans la pathogenèse de la SDP. Les patients ont été diagnostiqués avec la SDP, qui dans certains cas est associée à d'autres phénotypes tels que le TSA ou la déficience intellectuelle. J'ai trouvé quelques variants très rares qui ont un impact pathologique putatif sur le phénotype des patients selon l'analyse in silico. Un variant a été identifié dans le gène Sérine/thréonine-protéine kinase 33 (STK33) qui est un membre éloigné du groupe CAMK de sérine/thréonine kinases. Les membres de cette famille participent à la régulation de l'homéostasie calcique qui s'est avérée altérée chez les patients atteints de schizophrénie. Pour évaluer l'impact pathologique de la mutation dans STK33, j'ai créé un modèle cellulaire dans la lignée cellulaire SH-SY5Y par la technique CRISPR-Cas9 imitant la variante trouvée chez le patient. Pour décrire le phénotype de la lignée cellulaire mutée, j'ai effectué l'analyse de l'expression des gènes et des protéines ainsi que des expériences d'imagerie calcique.Le deuxième projet de ma thèse a été associé à la caractérisation d'une nouvelle mutation spontanée du gène Kcc2 chez la souris souffrant de crises tonico-cloniques spontanées à partir de l'âge de quatre mois. Le gène Kcc2 code le cotransporteur neuronal du chlorure de potassium KCC2, qui participe à la sortie des ions chlorure des cellules et au maintien de l'équilibre excitation/inhibition. Nous pensons que les variants de ce gène ont un fort potentiel de causer des dysfonctionnements neurodéveloppementaux. La plupart d'entre eux sont associés à l'épilepsie de la petite enfance avec crises focales migrantes (EIMFS), qui appartient à un groupe de syndromes épileptiques rares. Nous avons développé la présente étude dans le but de caractériser le premier modèle d'épilepsie spontanée chez la souris due à une mutation du gène Kcc2 en corrélant l'activité neuronale, l'apparence des crises et le comportement social et cognitif avec l'expression génique. À ce jour, ces études fonctionnelles n'ont pas été réalisées puisque les souris Kcc2-KO meurent quelques jours après la naissance et que les animaux hétérozygotes n'ont jamais été étudiés en détail. La mutation identifiée chez nos souris affecte le même acide aminé qui a été trouvé muté chez un patient EIMFS (R857L), offrant une occasion unique d'étudier l'étiologie de l'EIMFS in vivo. Jusqu'à présent, nous avons observé que chez les souris mutantes Kcc2, la production de la protéine est fortement diminuée dans le cortex cérébral, l'hippocampe et le striatum. De plus, le cross-linking assay et l'analyse immunohistochimique ont révélé une diminution de la protéine KCC2 au niveau de la membrane. En effectuant une iEEG, il a été possible d'observer le point typique pour épilepsie chez souris mutantes Kcc2. Pour le moment, des études comportementales ont révélé que les souris Kcc2 mutantes présentaient des déficits d'apprentissage et de mémoire. Ces résultats nous ont donné une solide base pour une évaluation plus approfondie de notre modèle et une possibilité d'obtenir un meilleur aperçu de la pathogenèse des EIMFS avec le but final de définir des interventions thérapeutiques.

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