Señalización intracelular mediada por sulfuro en arabidopsis thaliana

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En los últimos años el concepto que se tenía del sulfuro de hidrógeno (H2S) ha cambiado drásticamente, ya que ha pasado de ser considerado una sustancia tóxica a ser reconocido como una molécula señalizadora de importancia comparable al NO y el CO en mamíferos. En los sistemas vegetales, numerosos estudios han demostrado recientemente que el H2S incrementa la tolerancia frente a diferentes condiciones de estrés y participa en la regulación de procesos esenciales para las plantas como la fotosíntesis, el movimiento estomático y la autofagia. En el citosol de Arabidopsis thaliana la producción endógena de H2S es llevada a cabo por la enzima L-cisteína desulfhidrasa, DES1, que cataliza la desulfuración de la L-cisteína hasta sulfuro, amonio y piruvato. Para definir el papel funcional que desempeñan la proteína DES1 y la molécula de H2S en la regulación de determinados procesos fisiológicos en las plantas, se ha estudiado la expresión de este gen durante el desarrollo de la planta y a nivel tisular. Para ello, se han generado plantas transgénicas que expresan el gen reportero GFP bajo el control del promotor de DES1. Los datos obtenidos revelan que DES1 se expresa en todas las etapas del desarrollo de la planta, aunque dicha expresión es mayor en los estadíos tempranos (plántula) y en la madurez. La expresión es además muy ubicua, ya que la fluorescencia de la GFP se observa en el citosol de las células de la epidermis y del mesófilo, así como en el de las células guarda y es muy abundante en los hidátodos y en los tricomas. En las plantas maduras, la señal de la GFP se detecta en los tejidos florales y en las silicuas. La localización de la expresión de GFP, junto con la identificación de elementos reguladores dentro del promotor de DES1, apuntan a una regulación hormonal de dicho gen. Recientemente se ha demostrado que el ABA induce la expresión de DES1 y en el presente trabajo hemos determinado que el tratamiento in vitro con auxinas reprime de forma significativa la expresión de DES1. En el segundo capítulo de esta Tesis se ha estudiado el papel del H2S como regulador negativo de la autofagia. Mediante la visualización al microscopio confocal de plantas transgénicas que expresan la proteína de fusión GFP-ATG8 y el análisis por western-blot de la acumulación y lipidación de la proteína ATG8, hemos demostrado que el H2S (y no otras moléculas que contienen azufre o el propio amonio) es capaz de inhibir la autofagia inducida por privación de nitrógeno en raíces de Arabidopsis thaliana. Además, hemos determinado que el mecanismo por el cual se produce la represión de la autofagia por parte del H2S en Arabidopsis no está relacionado con su función antioxidante, ya que las especies reactivas del oxígeno producidas por la carencia de nitrógeno no son eliminadas por la presencia de H2S pero sí por la de compuestos antioxidantes. Sin embargo, la adición de compuestos antioxidantes no disminuye la inducción de la autofagia producida en nuestras condiciones experimentales, como ocurre con el H2S. Por lo que concluimos que el H2S reprime la autofagia a través de un mecanismo que es independiente de las condiciones redox. En el tercer capítulo de esta Tesis se ha profundizado en el estudio del mecanismo de regulación de la autofagia por parte del H2S. En base a las propiedades químicas que presenta la molécula de sulfuro, otro de los mecanismos de acción propuestos, además de su posible función antioxidante, es la modificación de los residuos tiólicos de las proteínas mediante Ssulfhidratación. Hemos realizado una búsqueda de proteínas ATG que presenten residuos de cisteína en sus secuencias y por tanto puedan ser dianas de este tipo de regulación y junto con lo descrito en la literatura, hemos propuesto a ATG4 como una posible diana de regulación. Mediante la realización de la técnica denominada "Tag-Switch" para la detección de proteínas sulfhidratadas, hemos demostrado que AtATG4a es una diana específica de S-sulfhidratación. Además, utilizando un ensayo reconstituido que incluye la proteína ATG8 de C. reinhardtii y la proteína AtATG4a hemos llevado a cabo ensayos de actividad proteolítica ATG4 in vitro. Nuestros datos nos permiten sugerir que la S-sulfhidratación produce una inhibición de la actividad de ATG4, lo que concuerda con nuestros resultados obtenidos in vivo que muestran que el sulfuro actúa inhibiendo el proceso autofágico.

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