Síntesis química y enzimática de biofenoles lipofilos del olivo con actividad antiinflamatoria. Optimización de la reacción de Krapcho

Description

En la presente Tesis Doctoral se ha realizado la síntesis de una serie de compuestos lipófilos, a partir de biofenoles contenidos tanto en la hoja de olivo como en el aceite de oliva virgen extra (AOVE), bajo la hipótesis general de que un aumento del carácter lipófilo tiene como consecuencia una mejora en la actividad biológica del compuesto, ya que en sistemas biológicos reales se producen procesos de absorción a través de membranas celulares de naturaleza lipófila. El cumplimiento de esta hipótesis nos llevaría a la conclusión de que una mayor lipofilia de un biofenol implica una mejor biodisponibilidad y una mayor eficiencia a la hora de ejercer la acción terapéutica. Concretamente, las transformaciones descritas en esta Tesis Doctoral encaminadas a tal fin se han llevado a cabo mediante procedimientos químicos o enzimáticos, o bien mediante una combinación de ambos. En primer lugar, se ha puesto a punto un nuevo método de síntesis del fenol 3,4-dihidroxifenilglicol (DHPG), compuesto natural minoritario contenido en el AOVE, a partir de cloruro de fenacilo en 3 pasos y con un rendimiento global del 38% mediante de una ruta sintética sencilla y fácilmente escalable. En segundo lugar, la síntesis de las dos nuevas familias de derivados lipófilos 10-14 y 23-27, se ha realizado mediante esterificación con ácidos carboxílicos de 2 a 16 átomos de carbono a partir de los catecoles O-bencil protegidos 4 y 17, derivados DHPG y de HT, respectivamente. En tercer lugar, se ha establecido la utilidad sintética de nuevos extractos enzimáticos procedentes de microorganismos con marcada actividad en reacciones de transesterificación en compuestos fenólicos y carbohidratos modelo, concluyendo que los mejores resultados se obtienen por la vía de la desacilación, que resulta ser muy selectiva. Gracias a ello, se ha logrado la síntesis de HTAc 29 a partir del derivado triacetilado de HT 142, y de una nueva familia de compuestos lipófilos del DHPG 30-39 a partir del derivado tetraacetilado 2. Esta familia se caracteriza por exhibir el grupo catecol desprotegido y por la sustitución en posición bencílica de un grupo acetoxi por un grupo alcoxi que proviene del alcohol utilizado como disolvente en la etapa de desacilación. Adicionalmente, en la desacilación de disacáridos peracetilados como la trehalosa y la sacarosa, se ha observado una preferencia por la desacilación selectiva de uno de los monosacáridos dejando el segundo inalterado, permitiendo así la desimetrización de la trehalosa y el acceso a nuevos derivados como el penta-O-acetilado 42 y el tetra-O-acetilado 43 en solo dos pasos: peracilación seguido de desacilación regioselectiva. Finalmente, la desacilación selectiva del ligstrósido y la oleuropeína peracetilados 147 y 148 con estos extractos enzimáticos ha permitido la síntesis regioselectiva de los compuestos 49 y 50, acetilados únicamente en el anillo de glucosa. Utilizando una lipasa comercial (Thermomyces lanuginosus) ha sido posible la acilación regioselectiva de la posición 6 de la glucosa de la oleuropeína con acilos de 2, 4, y 8 carbonos con rendimientos aceptables (56‒74%). En cuarto lugar, algunos de los derivados sintetizados han sido ensayados en diferentes modelos de inflamación. De este modo, el glicol 3 y el HTAc 29 han demostrado ser eficientes moduladores de la respuesta inflamatoria de macrófagos peritoneales estimulados con LPS, consiguiendo modular el nivel de nitritos y la expresión de enzimas proinflamatorias en la célula. Más aún, el derivado 29, ha demostrado ser un excelente agente terapéutico en enfermedades de índole inflamatoria como la colitis ulcerosa, la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico, combatiendo la inflamación y corrigiendo el nivel de estrés oxidativo asociado a estas patologías. Siguiendo esta tendencia, estudios preliminares con macrófagos peritoneales señalan que los derivados lipófilos de la oleuropeína tienen un efecto similar al alcanzado por el HTAc 29. Tanto el peracetilado de la oleuropeína 148, como los derivados parcialmente acilados obtenidos enzimáticamente, el tetraacetilado 50 y el monoacetilado 46, son mejores que la oleuropeína, en cuanto a la modulación de la respuesta inflamatoria y el nivel de estrés oxidativo de macrófagos peritoneales. En quinto lugar, se ha optimizado la reacción de desmetoxicarbonilación de Krapcho aplicada a la oleuropeína para obtener con rendimiento aceptable la oleaceína acetilada o aceoleína 51 junto con el aglicón del oleurósido deshidratado (DOA) acetilado 52, mediante calentamiento a 150 ºC en DMSO seguido de acetilación y sin purificación previa. Esta misma estrategia biomimética ha podido ser implantada en extractos fenólicos del aceite de oliva conteniendo los aglicones monoaldehídicos de ligstrósido y oleuropeína 65 y 66, así como con los mismos aglicones purificados por separado, lo que permite no solo un nuevo acceso a oleocantal y oleaceína, sino también la posibilidad de enriquecer extractos fenólicos fáciles de obtener de AOVEs en oleocantal y oleaceína, dos compuestos de alto valor añadido y con aplicación en la industria Farmacéutica y de la Alimentación. Se han explorado diferentes vías de estabilización de la oleaceína con el objetivo de posibilitar su purificación cromatográfica, obteniéndose de esta manera el ya citado derivado acetilado de la oleaceína 51 y también los compuestos derivados de las reducciones regioselectivas 59 y 60, además de los monoacetales 61‒64. Los compuestos acetilados 51 y 52 que resultan de la reacción de Krapcho sobre la oleuropeína y posterior acetilación han sido ensayados, junto con los derivados lipófilos de ligstrósido 49 y 147, y de oleuropeína 50-52 y 148 como agentes antiproliferativos frente a diversas líneas celulares de tumores sólidos humanos. Los resultados muestran una progresiva mejora de los datos de inhibición de crecimiento celular conforme aumenta la lipofilia de los glucósidos secoiridoides. Además, tanto 51 como 52 presentan mejores resultados que el HT peracetilado en todas las líneas celulares ensayadas. En los compuestos con mejores actividades, se observa una mayor selectividad hacia las células de cáncer cérvico-uterino (HeLa) con GI50 de (8.6 ± 4.4) μM, (23 ± 4.3) μM y (15 ± 3.2) μM para 148, 51 y 52 respectivamente. Finalmente, se ha propuesto un método de cuantificación mediante 1H-RMN de los derivados aldehídicos de naturaleza secoiridoide presentes en la fracción fenólica de AOVEs, con el que se consigue la cuantificación de oleaceína 53, oleocantal 57 y los aglicones monoaldehídicos de ligstrósido 65 y oleuropeína 66 mediante la integración de las señales de los protones aldehídicos por encima de 9.0 ppm.

Abstract

In this PhD Thesis it is decribed the synthesis of a series of lipophilic compounds, from biophenols contained in both olive leaf and extra virgin olive oil (EVOO), under the general hypothesis that an increase in the lipophilic character results in an improvement in the biological activity of the compound, as in real biological systems absorption processes take place through lipophilic cell membranes. The fulfillment of this hypothesis would lead us to the conclusion that a greater lipophilicity of a biophenol leads to a better bioavailability and to a greater efficiency in the exercise of the therapeutic action. Specifically, the transformations described in this PhD Thesis aimed at this purpose have been carried out by chemical or enzymatic procedures, or by a combination of both methodologies. First, a novel method for the synthesis of phenol 3,4-dihydroxyphenylglycol (DHPG), a natural compound contained in EVOO, has been developed from phenacyl chloride in 3 steps and with an overall yield of 38% through a simple and easily scalable synthetic route. Second, the synthesis of two new families of lipophilic derivatives 10‒14 and 23‒27 was performed by esterification with carboxylic acids of 2 to 16 carbon atoms from O-benzyl protected catechols 4 and 17, derived from of DHPG 3 and HT 67, respectively. Third, it has been established the synthetic utility of new enzymatic extracts from microorganisms with marked activity in transesterification reactions on model phenols and carbohydrates compounds, concluding that the best results are obtained for deacylation reactions, which turns out to be very selective. As a result, the synthesis of HTAc 29 has been achieved from the triacetylated derivative of HT 142, and also a novel family of lipophilic compounds of DHPG 30-39 was obtained from peracetyl DHPG 2. This family is characterized by displaying the deprotected catechol group and by the substitution in benzylic position of an acetoxy group by an alkoxy group derived from the alcohol used as solvent in the deacylation step. Additionally, in the deacylation of peracetylated disaccharides such as trehalose and sucrose, a preference has been observed for the selective deacylation of one of the monosaccharides leaving the second unchanged, allowing the desymmetrization of trehalose and the access to new derivatives such as the penta-O-acetylated 42 and tetra-O-acetylated 43 in just two steps: peracylation followed by regioselective deacylation. Finally, selective deacylation of the peracetylated ligstroside 147 and oleuropein 148 with these enzyme extracts has allowed the regioselective synthesis of compounds 49 and 50, acetylated only in the glucose ring. The regioselective acylation with acceptable yield (56‒74%) of the O-6 position of the glucose moiety of oleuropein with acyl groups of 2, 4 and 8 carbons was achieved by using Thermomyces lanuginosus, a commercial lipase. Forth, some of the synthesized derivatives have been tested in different models of inflammation. Thus, glycol 3 and HTAc 29 have been shown to be efficient modulators of the inflammatory response of LPS-stimulated peritoneal macrophages, modulating the level of nitrites and the expression of proinflammatory enzymes into the cell. Moreover, derivative 29 has been shown to be an excellent therapeutic agent in inflammatory diseases such as ulcerative colitis, rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus, combating inflammation and efficiently correcting the level of oxidative stress associated to these pathologies. Following this trend, preliminary studies with peritoneal macrophages indicate that the lipophilic derivatives of oleuropein have a similar effect to that observed for the HTAc 29. Both the peracetylated oleuropein 148 and the partially acylated derivatives obtained enzymatically, the tetraacetylated 50 and the monoacetylated 46, are better than the oleuropein, in terms of the modulation of the inflammatory response and the level of oxidative stress of peritoneal macrophages. Fifth, the Krapcho demethoxycarbonylation reaction applied to the oleuropein has been optimized to obtain, with acceptable yield, the acetylated oleacein or aceolein 51, together with the acetylated dehydrated oleuroside aglycone (DOA) 52, by heating at 150 °C in DMSO followed by acetylation, without prior purification. The same biomimetic strategy has been applied to phenolic extracts of olive oil containing the monoaldehyde aglycones of ligstroside and oleuropein 65 and 66, as well as to the same aglycones previously separated and purified. This methodology allows not only a new access to oleocanthal and oleacein, but also the possibility of enriching phenolic extracts, easy to obtain from EVOOs, in oleocantal and oleacein, two important highly active biophenols with application in the Pharmaceutical and Food industries. Different synthetic routes for stabilizing oleacein 53 have also been explored in order to enable their chromatographic purification, obtaining the aforementioned acetylated derivative 51 and the compounds derived from regioselective reductions 59 and 60, besides to monoacetals of oleacein and oleocanthal 61‒64. Compounds 51 and 52 resulting from the Krapcho reaction on oleuropein followed by acetylation have been tested, together with the lipophilic derivatives of ligstroside 49 and 147 and oleuropein 50-52 and 148 as antiproliferative agents against various human solid tumor cell lines. The results show a progressive improvement of the cellular growth inhibition data as the lipophilicity of the secoiridoid glycosides increases. In addition, both 51 and 52 present better results than the peracetylated HT 142 in all cell lines tested. The compounds with better activity show a higher selectivity to cells of cervix-uterine cancer (HeLa) with GI50 (8.6 ± 4.4) μM, (23 ± 4.3) μM and (15 ± 3.2) μM for 148, 51 and 52 respectively. Finally, a method of quantification by 1H-NMR of the aldehyde secoiridoid derivatives present in the phenolic fraction of the EVOOs has been proposed, allowing quantification of oleacein 53, oleocanthal 57, and monoaldehyde aglycones of ligstroside 65 and oleuropein 66 by integration of the signal corresponding to aldehyde protons above 9.0 ppm.

Abstract

Premio Extraordinario de Doctorado US

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