Identifying the regulatory mechanisms and functional consequences of SUMOylation at the mammalian synapse

Description

SUMOylation is a dynamic post-translational modification that consists in the covalent but reversible enzymatic conjugation of the Small Ubiquitin-like MOdifier (SUMO) protein on specific lysine residues of target proteins. In the last 10 years, SUMOylation has emerged as an important regulator of the neuronal function, playing a role in brain development, neuronal excitability and synaptic transmission and plasticity. Importantly, alterations in the SUMOylation homeostasis process are associated with a variety of brain disorders. Nevertheless, the regulatory mechanisms remain poorly studied and the available repertoire of identified SUMO substrates at synapses is still extremely limited. The SUMOylation/deSUMOylation balance is orchestrated by the coordinated action of the sole SUMO-conjugating enzyme Ubc9 and SUMO-deconjugating enzymes called SENPs. A tight regulation of this balance is therefore critical to the brain function and its disruption is associated with several neurological disorders. We previously demonstrated that a short activation of mGlu5R transiently traps Ubc9 at the post-synapse, resulting in a rapid increase in the overall synaptic SUMOylation and changes in neuronal excitability. A sustained activation of mGlu5R leads to post-synaptic accumulation of SENP1 and a decrease in synaptic SUMOylation to basal levels. Given that both processes are controlled by the activation of mGlu5R but on a different timescale, other mechanisms must coexist to regulate their spatiotemporal balance at synapses. Using a combination of advanced live-cell imaging, biochemical and pharmacological approaches, we revealed a bidirectional regulation of synaptic deSUMOylation targeting by the group I mGluRs and highlight how PKC and CaMKII activation as well as the polymerization of microtubules drive the neuronal and synaptic redistribution of SENP1. The poor identification of endogenous synaptic SUMOylation substrates is mainly due to the low levels of SUMOylated proteins at synapses but also to the developmental ages investigated. To overcome these difficulties, we combined subcellular fractionation approaches on post-natal (P14) rat brains with specific SUMO2/3 immunoprecipitation to isolate synaptic SUMO2/3-ylated proteins. Then using Orbitrap mass spectrometry (MS), we identified around 800 synaptic SUMO2/3-ylated proteins including the previously reported SUMO targets Ubc9, CASK and Synapsin1. We identified many novel synaptic SUMO targets including PSD95 and SynGAP, further highlighting the central role of SUMOylation in the synaptic function. Interestingly, many of the proteins identified are directly linked to neurological disorders suggesting that the SUMOylation process per se could participate in the aetiology of these brain diseases. Altogether, my PhD work provides additional insights into the sequential activity-dependent regulatory mechanisms driving the homeostasis of protein SUMOylation at the mammalian synapse and establishes the first detailed cartography of synaptic SUMO2/3 substrates.

Abstract (French)

Les modifications post-traductionnelles sont essentielles à la régulation des fonctions protéiques et, par conséquent, au maintien de l'intégrité cellulaire. Ces modifications interviennent à tous les niveaux de la communication neuronale. Lors de mon doctorat, j'ai étudié l'une de ces modifications, la SUMOylation. Elle consiste en la conjugaison enzymatique covalente mais réversible, de la protéine SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) sur des résidus lysine spécifiques de protéines cibles. Au cours des dix dernières années, la SUMOylation est apparue comme un régulateur important de la fonction neuronale, jouant un rôle dans le développement du cerveau, l'excitabilité neuronale, la transmission et la plasticité synaptique. Il existe par ailleurs une balance entre l'état SUMOylé et déSUMOylé des protéines cérébrales, permettant une régulation fonctionnelle à la fois dans le temps et dans l'espace. Il est important de noter que les altérations du processus d'homéostasie de la SUMOylation sont associées à une variété de troubles cérébraux. Pour mieux comprendre les fonctions synaptiques de la SUMOylation, il est donc essentiel d'identifier les protéines de la synapse modifiées par SUMO ainsi que de déterminer les mécanismes qui y régulent la balance SUMO/déSUMOylation.Cependant, les mécanismes de régulation restent à élucider et le répertoire disponible des substrats SUMO identifiés au niveau des synapses est encore extrêmement limité. Mon travail de thèse a donc été découpé en deux axes : l'étude de la régulation synaptique de la balance SUMOylation/déSUMOylation et l'identification et la caractérisation d'un SUMOylome à la synapse.La balance SUMOylation/désSUMOylation est maintenue par l'action coordonnée de la seule enzyme de conjugaison SUMO, Ubc9, et des enzymes de déSUMOylation appelées SENP. Nous avons dans unp remier temps démontré qu'une activation brève des récepteurs métabotropique du glutamate mGlu5R piège transitoirement Ubc9 aux post-synapses, ce qui entraîne une augmentation rapide de la SUMOylation synaptique globale et des changements dans l'excitabilité neuronale. Une activation prolongée des récepteurs mGlu5R entraîne une accumulation post-synaptique de SENP1 et une diminution de la SUMOylation synaptique. Étant donné que les deux processus sont contrôlés par l'activation des récepteurs mGlu5R mais sur des échelles de temps différentes, d'autres mécanismes doivent coexister pour réguler cet équilibre au niveau des synapses. En utilisant une combinaison d'imagerie en temps réel et d'approches biochimiques et pharmacologiques, nous avons montré une régulation bidirectionnelle de la déSUMOylation synaptique par les mGluRs du groupe I (mGluR1 et 5) et mis en évidence un rôle de l'activation des kinases PKC et CaMKII ainsi que la polymérisation des microtubules dans la redistribution synaptique de SENP1.En combinant fractionnements subcellulaires à partir de cerveaux de rats post-nataux (P14) et immunoprécipitations SUMO2/3 spécifiques pour isoler les protéines synaptiques SUMO2/3-ylées, nous avons identifié 803 protéines synaptiques SUMOylées. Ces protéines sont importantes pour la fonction synaptique comme par exemple Synapsin3 impliquée dans l'exocytose. Parmi les nouvelles cibles identifiées, on retrouve et SynGAP, ce qui souligne le rôle central de la SUMOylation dans la fonction synaptique. De nombreuses autres protéines identifiées sont directement impliquées dans des troubles neurologiques laissant suggérer une participation du processus de SUMOylation dans l'étiologie de ces maladies cérébrales.Ainsi, mes travaux de thèse ont permis de collecter des informations importantes sur les mécanismes de régulation séquentiels dépendants de l'activité qui conduisent à l'homéostasie de la SUMOylation des protéines au niveau de la synapse et d'établir la première cartographie des cibles SUMO2/3 synaptiques.

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