Análisis metabólico y molecular del contenido de ácido linoleico en el fruto del olivo (Olea europea)

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El objetivo general de este trabajo es identificar los genes/enzimas responsables del contenido de ácido linoleico en la aceituna, así como los factores implicados en su regulación. En particular, se abordarán los siguientes objetivos específicos: 1) Estudiar las rutas de biosíntesis de ácido linoleico usando cultivos de callo de olivo como sistema modelos. - Analizar la cinética de incorporación y desaturación de oleico y linoleico radiactivos durante la biosíntesis de glicerolípidicos. - Investigar el efecto de la temperatura y la intensidad luminosa sobre la incorporación y desaturación de oleico radiactivo. 2) Caracterizar la estructura y regulación de los genes responsables del contenido de ácido linoleico en la aceituna. - Aislar y secuenciar clones de cDNA correspondientes a oleato desaturasas de olivo. - Expresar funcionalmente los genes FAD2 y FAD6 de olivo en hospedador heterólogo. - Determinar la organización genómica de los genes FAD2 y FAD6 de olivo. - Estudiar la regulación de la expresión de los genes FAD y FAD6 de olivo en relación al contenido de ácido linoleico. CONCLUSIONES 1. En cultivos fotomixotróficos de callo de olivo, tanto [1-14C]oleato como [1-14C]linoleato se incorporan rápidamente a todos los lípidos estudiados, tanto microsomales como plastidiales. Tras ser activados a acil-Coas, la actividad lisofosfatidilcolina aciltransferasa y no la ruta de Kennedy es la principal responsable de la entrada de ambos precursores radiactivos al metabolismo lipídico, principalmente a la biosíntesis de triacilgliceroles, en la que la actividad fosfolípido:diacilglicerol aciltransferasa contribuye de forma importante. 2. En callos de olivo, el plastidio es el sitio preferencial para la desaturación, tanto del [1-14C]oleico como del [1-14C]linoleico, por acción de las enzimas oleato desaturasa plastidial y linoleato desaturasa plastidial, respectivamente. 3. El incremento de la temperatura de incubación de los callos de olivo promueve específicamente la biosíntesis de triacilgliceroles, y afecta negativamente a la oleato desaturasa microsomal y a la linoleato desaturasa plastidial. Por su parte, la intensidad luminosa parece regular alas oleato desaturasas, tanto microsomal como plastidial. 4. Se han aislado y secuenciado tres clones completos de cDNA de olivo, dos de ellos que codifican la oleato desaturasa microsomal (FAD2-1 y FAD2-2) y el otro correspondiente a la plastidial (FAD6). Sus secuencias de aminoácidos deducidas muestran las características típicas de las desaturasas asociadas a membranas. El análisis filogenético de los tres genes de la oleato desaturasa de olivo estableció que mientras la FAD6 de olivo se situaba en una rama junto al resto de las FAD6 de plantas, las dos proteínas FAD2 de olivo se agrupaban en el grupo correspondiente a las enzimas FAD2. 5. La identidad funcional de los genes de las oleato desaturasas de olivo se confirmó mediante expresión funcional heteróloga. Por un lado, los genes FAD2-1 y FAD2-2 se sobreexpresaron en Saccharomyces cerevisiae. Por otro lado, el gen FAD6 se sobreexpresó en Escherichia coli. 6. El análisis de Southem blot genómico demostró que existen al menos dos copias de cada uno de los dos genes FAD2 en el genoma del olivo, mientras que existe, al menos, una copia del gen FAD6. 7. El análisis de expresión de los genes FAD2-1, FAD2-2 y FAD6 de olivo en distintos tejidos de olivo y a lo largo del desarrollo y maduración de la aceituna puso de manifiesto que estaban regulados de forma espacial y temporal. 8. Los tres genes de la oleato desaturasa de olivo muestran un papel fisiológico diferencial. Mientras FAD2-1 está posiblemente implicado en la biosíntesis del ácido linleico presente tanto en los lípidos de reserva en semillas jóvenes, como en los lípidos cloroplásticos en drupa joven y hojas, FAD2-2 parece responsable del contenido de linoleico en los lípidos de reserva de la semilla madura y el mesocarpo. Por su partem FAD6 parece implicado en la desaturación de oleico en los lípidos cloroplásticos de hojas. 9. La evolución del contenido de ácido linoleico y los niveles de expresión relativa de los genes de las oleato desaturasas a lo largo del periodo completo de desarrollo y maduración, depende de las variedades de aceituna, siendo el gen FAD2-2 el principal responsable del contenido de ácido linoleico en los aceites de oliva. 10. En los olivos de la variedad Arbequina cultivados en regadío, se produce un aumento en los niveles de expresión de FAD2-2 en mesocarpo, dando lugar a un aumento en el porcentaje de ácido linoleico. 11. No se detectaron diferencias significativas en el contenido de ácido linoleico de mesocarpo de aceitunas de las variedades Picual y Arbequina cuando se almacenaron a diferentes temperaturas durante 21 días. Aunque sí se observó un incremento en los niveles de expresión del gen FAD2-2 en mesocarpo de aceitunas de la variedad Arbequina tras el almacenamiento a las tres temperaturas estudiadas, si bien no correlacionaba con el contenido de ácido linoleico. 12. La incubación de las aceitunas a temperatura baja, alta, en oscuridad o tras producirle daño por herida afectaba de forma diferente a la transcripción de los genes FAD2-1, FAD2-2 y FAD6 dependiendo de la variedad.

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