Regulation of Nodule Senescence in Medicago truncatula

Description

Leguminous plants are able to associate with rhizobium to develop de novo a root organ, the root nodule. Root nodule can reduce atmosphere nitrogen into available nitrogen to plant host. Thus, the nitrogen-fixing symbiosis plays important roles in agriculture with direct nitrogen inputs to crops. In the first part of the thesis, we intended to characterize the impact of the bacterial GSH deficiency on the bacteroid differentiation and the nodule functioning during the symbiotic interaction between Medicago truncatula and Sinorhizobium meliloti. Physiological, biochemical, cellular and genetic markers were used to describe the nodule functioning at ten and twenty days after plant inoculation. Our results showed that the bacterial GSH deficiency does not affect bacteroid differentiation. However, it induces an early nodule senescence process in M. truncatula. During nodule senescence, proteolytic activities are increased terminated with the final degradation of bacteroids and plant cells. Hence, proteases are found to be the hallmarks of nodule senescence. At the onset of nodule senescence, a papain family cysteine protease, MtCP6, is a good molecular marker for the initiation of nodules senescence. In the second part of the thesis, serial promoter deletion analysis of a cysteine protease gene MtCP6 was conducted to identify cis regulatory element involved in the transcriptional regulation of nodule senescence of M. truncatula. Thereafter, identified cis-regulating region (67bp, NS) was validated to function in transcription activation in nodule zone III-IV. We have shown that tetramers of NS can increase the transcription into nodule senescence zone. In order to determine the significance of NS to the expression compared to the full promoter (-1,710bp), a functional analysis was conducted with deletion of NS from the full promoter and the analysis of a minimal promoter (-254bp). In addition, the potential roles of CAAT, WRKY and Dof motifs localized at 5' of NS sequence was validated by site-specific mutagenesis. Finally, yeast one hybrid experiment was performed to identify transcription factors interacting with NS DNA fragment. Preliminary resulrs are presented. Taken together, these data allow a better understanding of the regulation and the operation of the nodule senescence.

Abstract (French)

Les légumineuses peuvent s'associer aux rhizobia pour développer de nouveau un organe racinaire, la nodosité racinaire. La nodosité racinaire peut réduire l'azote atmosphérique en azote disponible pour l'hôte végétal. Ainsi, la symbiose fixatrice d'azote joue un rôle important dans l'agriculture avec des apports directs d'azote aux plantes cultivées. Dans la première partie de la thèse, nous avons caractérisé l'impact de la carence bactérienne en GSH sur la différenciation bactérioïde et le fonctionnement des nodules lors de l'interaction symbiotique entre Medicago truncatula et Sinorhizobium meliloti. Des marqueurs physiologiques, biochimiques, cellulaires et génétiques ont été utilisés pour décrire le nodule fonctionnant dix et vingt jours après l'inoculation de la plante. Nos résultats ont montré que la carence bactérienne en GSH n'affecte pas la différenciation bactérioïdienne. Cependant, elle induit un processus précoce de sénescence des nodosités chez M. truncatula. Au cours de la sénescence des nodosités, les activités protéolytiques sont augmentées et se terminent par la dégradation finale des bactéroïdes et des cellules végétales. Par conséquent, les protéases se révèlent être les enzymes caractéristiques de la sénescence des nodosités. Au début de la sénescence nodositaire, une cystéine protéase de la famille des papaïnes, MtCP6 est un bon marqueur moléculaire pour l'initiation de la sénescence des nodules. En ce qui concerne la deuxième partie de la thèse, une analyse consistant en une série de délétion du promoteur de MtCP6 a été réalisée pour identifier les séquences régulatrices présentes sur le promoteur CP6 et impliquées dans la sénescence nodulaire. Afin de comprendre la régulation transcriptionnelle de la sénescence nodositaire chez M. truncatula. Ensuite, la région cis-régulatrice identifiée (67 pb, NS) a été validée pour fonctionner dans l'activation de la transcription dans la zone nodulaire III-IV. Nous avons pu montrer que les tétramères de NS peuvent induire la transcription dans la zone de sénescence de la nodosité. Afin de déterminer l'importance de NS par rapport au promoteur complet (-1710 pb), une analyse fonctionnelle a été réalisée avec suppression de la boîte NS sur le promoteur complet et sur le promoteur minimal (-254 pb). De plus, la validation les rôles potentiels des motifs CAAT, WRKY et Dof localisés dans la séquence NS en 5' a été réalisée à l'aide de délétions sites spécifiques. Finalement, la technique de "yeast-one-hybrid" a été utilisée pour identifier des facteirs de transcription interagissant avec le fragment NS. Les résultats préliminaires sont présentés.Dans leur ensemble, les résulats permettent une meilleure compréhension de la régulation et du fonctionnement de la sénescence nodulaire.

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