Functioning of the phosphatidylserine / phosphatidylinositol 4 phosphate exchangers at the interface between the endoplasmic reticulum and the plasma membrane

Description

Lipid transfer proteins (LTPs) facilitate the solubilization of lipids and ensure their distribution between distinct biological membranes. Osh6p and Osh7p proteins in yeast cells and the ORP5 and ORP8 proteins in human cells are homologous LTPs that share a common function: they transport phosphatidylserine (PS) from its site of synthesis, the endoplasmic reticulum (ER), to the plasma membrane where PS is abundant and essential for a number of cellular functions. To perform this vectorial transport, these proteins exchange PS for a second lipid – phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P)– that is next transported in the opposite direction from the plasma membrane to the ER. In the cell, PI(4)P is continuously made in the plasma membrane and hydrolyzed in the ER, respectively by PI 4 kinases and a PI phosphatase, and this maintains a constant concentration gradient between the two membranes. By exploiting this gradient, Osh6p/Osh7p and ORP5/8 derive the necessary energy to contribute to the accumulation of PS in the plasma membrane. About Osh6p, our lab measured in vitro that this exchange mechanism is very fast, and this is also observed in yeast. This is likely sufficient to supply the plasma membrane whose surface area doubles in a cell division time, with the appropriate amount of PS.During my thesis, I examined three aspects of the PS/PI(4)P exchange mechanism. First, I studied how Osh6p/Osh7p ensure rapid lipid transfer at the interface of two membranes, one that is slightly anionic (i.e., the ER) and the other one that is very anionic (i.e., the plasma membrane). Second, I examined what imparts Osh6p and Osh7p with the ability to accurately transport PS solely between these two membranes in yeast. Finally, I examine whether Osh6p and ORP8 differently transfer PS depending on the nature of its acyl-chains.Using biochemical, in vitro reconstitution assays and real-time fluorescence spectroscopy approaches, I demonstrated, first that Osh6p by undergoing a conformation change when encapsulating PS or PI(4)P limits its retention time on anionic membranes during an exchange process, and is therefore very rapid. Second, I contributed to demonstrating that Osh6p performs accurate exchange, only at the ER/plasma membrane interface, by interacting with the membrane tethering factor Ist2p. All these studies improve our understanding of lipid flows in the cell and open new perspectives concerning the regulation of these essential machineries critical for cell function.

Abstract (French)

Les protéines de transfert lipidique (LTPs) favorisent la solubilisation des lipides et assurent leur distribution entre des membranes biologiques distinctes. Les protéines Osh6p et Osh7p dans les cellules de levure et les protéines ORP5 et ORP8 dans les cellules humaines sont des LTPs homologues qui partagent une fonction commune : elles transportent la phosphatidylsérine (PS) depuis son lieu de synthèse, le réticulum endoplasmique (RE) vers la membrane plasmique où la PS est abondante et essentielle pour les fonctions cellulaires. Pour exécuter ce transport vectoriel, la PS est échangée contre un second lipide – le phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) – qui est ensuite transporté en sens inverse depuis la membrane plasmique vers le RE. Dans la cellule, le PI(4)P est continuellement produit dans la membrane plasmique et dégradé dans le RE, respectivement par des PI 4 kinases et une PI-phosphatase, ce qui permet d'entretenir un gradient de concentration de PI(4)P constant entre les deux membranes. En exploitant ce gradient, Osh6p/Osh7p et ORP5/8 tirent l'énergie nécessaire à l'accumulation de PS dans la membrane plasmique.Avec Osh6p, le laboratoire a observé in vitro que ce mécanisme d'échange de lipides est très rapide et ceci est vérifié dans la levure. Ceci est sans doute suffisant pour approvisionner la membrane plasmique, dont la surface double en un temps de division cellulaire, avec la quantité appropriée de PS. Durant ma thèse, j'ai examiné deux aspects du mécanisme d'échange PS/PI(4)P. Premièrement, j'ai étudié comment Osh6p/Osh7p assurent le transport rapide de ces lipides à l'interface entre deux membranes, l'une étant légèrement anionique (le RE) et l'autre très anionique (la membrane plasmique). Deuxièmement, j'ai étudié ce qui permet à Osh6p et Osh7p de transporter la PS avec précision uniquement entre ces deux membranes dans la levure. Par des approches de biochimie, de reconstitution in vitro et de spectroscopie de fluorescence en temps réel, j'ai pu mettre en évidence, premièrement, qu'Osh6p, en changeant de conformation lors de la capture de la PS ou du PI(4)P, limitait son temps de rétention sur des membranes anioniques lors d'un processus d'échange, ce qui lui permet de l'effectuer rapidement. Deuxièmement, j'ai contribué à montrer qu'Osh6p effectuait des échanges précis, uniquement à l'interface RE/membrane plasmique, en interagissant avec le facteur d'attachement de membranes Ist2p. L'ensemble de ces études améliore notre compréhension des flux lipidiques dans la cellule et ouvre de nouvelles perspectives concernant la régulation de ces machineries essentielles au fonctionnement de la cellule.

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